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betwaylogin[L6,K11]-IsCT抑菌性能及其稳定性研究
新闻來源:【管理员】    发布时间:2018-07-23   浏览次数:457

[摘要] IsCT最初是从蝎子中分离出的一种非细胞选择性线性betwaylogin,为了将其应用于动物饲料,需研究其对常见致病菌的抑制和杀灭作用。本试验采用微量稀释法和琼脂扩散法对ISCT衍生物[L6,K11]-IsCT的抗菌活性及其稳定性进行探索。结果显示,相对于金黄色葡萄球菌,[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌具有更好的抑制作用,其对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。另外,该衍生物对高温表现出很好的稳定性,同时具有很好的酸碱耐受性和人工胃液耐受性。经121℃、0.12MPa处理30min,以及2.0≤pH≤11.0处理30min或人工胃液2h孵育处理后,依然能保持很好的抑菌活性。 [关键词] betwaylogin;衍生物;[L6,K11]-IsCT;抑菌活性;稳定性 betwaylogin具有较好的广谱抑菌性能,对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等均有不同程度的抑制作用(刘忠渊等,2003)。近年研究发现许多betwaylogin对某些真菌、病毒及癌细胞等也均具有强有力的杀灭活性(许玉澄等,1998;王军等,2005;Hans,1995)。相对于抗生素而言,具有无残留、效价高、无毒害作用等优点(王燕,2007;卢晓风等,1999),是抗生素潜在的替代品。蝎子是中国的一种传统名贵中药,2000多年前就记载了蝎子的药用史,其具有抗肿、杀虫、抑菌和抗菌功效,其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一类由10~100个氨基酸组成的具有多种生物活性的小分子多肽,它们可以选择性和特异性的与细胞膜上的膜蛋白相互作用,从而改变细胞对离子的通透能力,调节细胞体积、pH、膜电位、兴奋性等多种细胞代谢过程和细胞分泌、激素作用和信号转导等多种生理过程(董伟华等,1999;陈冰等,2001;肖帆等,2003)。因此,从蝎毒素中提取出的betwaylogin具有重要的理论研究意义和应用开发价值。IsCT是来源于马达加斯加黑爪蝎(Opisthacanthusmadagascariensis)毒液里的一种细胞毒性(cytotoxic)的线性肽(Dai等,2001),其分子质量为1502.9u,由不含半胱氨酸的13个氨基酸残基组成,富含疏水氨基酸(3个Ile,2个Leu)和碱性氨基酸(2个Lys),具有良好的抑菌性能,但由于对哺乳动物红细胞具有溶血活性(Blondelle等,1993;Subbalakshmi等,2000),所以其应用受到了一定的限制。有报道指出,作为IsCT的衍生物,[L6,K11]-IsCT具有极低的溶血性(Subbalakshmi等,2000;Lee等,2004),其分子质量大小为1459u,有着广泛的应用前景。目前,对于其具体的抗菌活性及环境稳定性少有报道。本试验旨在通过微量稀释法和琼脂扩散法检测其抑菌性能及环境稳定性,为该类产品在动物饲料中的应用奠定基础。
 
1、材料与方法
 
1.1 受试体和试剂

试验用betwaylogin[L6,K11]-IsCT由深圳市圣必威体育生物技术有限公司研发中心自制,纯度为95.1%;金黄色葡萄球菌和大肠杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心,编号分别为ATCC8739、ATCC6538;胃蛋白酶、胰蛋白酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司;80万单位的氨苄青霉素购自石家庄制药集团;其余常用试剂为国产分析纯试剂。
1.2 主要仪器和设备

V-1600可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);KE1106精密台式pH计(武汉科易科技有限公司);TGL-168高速台式离心机(Beckman);不同量程的移液器(Thermo);超净工作台(苏州净化设备有限公司);Φ90mm平皿;Φ5mm 打孔器。
1.3 培养基及各种处理液

①LB液体培养基:牛肉膏10g、蛋白胨10g、氯化钠5g,加水定容至1000mL,pH7.2,1×105Pa(121℃)高压灭菌20min。
②LB固体培养基:除液)高压灭菌20min,备用。或采用45g营养琼脂配制1000mL固体培养基。
③Mueller-HintonationBroth培养基:参照GB/T4789.28-2003的方法配制。MH平板:配制1000mLMH培养基加入15g琼脂。溶解后1×1055 Pa(121 ℃ )高压灭菌20 min,冷却至80℃后倒平板备用。
④人工胃液:取1、0.25、0.125g胃蛋白酶,分别与1.64mL1mol/L稀盐酸、80mL蒸馏水混匀,均定容至100mL,备用。
⑤人工肠液:磷酸二氢钾0.68g,加水50 mL,用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH至6.8;另分别取1、0.25、0.125g胰蛋白酶,加水适量使其溶解,两液混合后,均定容至100mL,备用。
1.4 betwaylogin产品抑菌性及稳定性的测定

1.4.1 琼脂扩散法测定betwaylogin[L6,K11]-IsCT抑菌活性
参考Huimark等(1980)介绍的琼脂扩散法测定betwaylogin的抑制活性。采用普通琼脂培养基,活化培养后菌液浓度稀释成106~107CFU/mL。在无菌操作下,注入加热融化的培养基20mL于直径9cm的培养皿中,使其在底部均匀分布,当冷却到不烫手(45℃)时,分别向每个培养皿中加入2mL菌悬液,摇匀,凝固后,在无菌操作条件下用已消毒的打孔器(Φ5mm)打孔,剔除中间琼脂,然后用移液枪注入各试验组待测样品,平放于37℃恒温培养箱中培养15h,观察小孔周围有无抑菌圈及抑菌圈大小。抑菌圈大小测定方法:以抑菌圈的直径减去加样孔直径(5mm)。
1.4.2 微量稀释法测定betwaylogin[L6,K11]-IsCT 对大肠杆菌的最小抑菌浓度
以无菌蒸馏水溶解betwaylogin[L6,K11]-IsCT,制成3200μg/mL 的betwaylogin溶液,再以MH 培养基对其进行倍比稀释,使其终浓度为1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL,于U型微量板每孔加入100μL。将以MH培养基活化培养的大肠杆菌菌液浓度稀释到106~107CFU/mL后,作为接种菌液。在U型微量板每孔加入5μL菌液,另1孔为不含药物的培养基,作为对照。37℃恒温培养箱中培养15h后,观察结果。结果判断:在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC,当阳性对照孔(即不含抗菌物质)细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时,应记录抑制细菌生长的最高药物浓度;如出现多处跳孔,则不应报告结果,需重复试验。
1.4.3 betwaylogin[L6,K11]-IsCT 热稳定性的测定
将配制好的0.5mg/mLpH7.0的betwaylogin[L6,K11]-IsCT 溶液分装至6支EP管,分别于4、37、55、75、95℃水浴处理30min;另一组于121℃、0.12MPa处理30min,同时以无菌水和未处理的betwaylogin作对照,然后通过琼脂扩散法检测其对大肠杆菌的抑菌活性。
1.4.4 不同pH缓冲液对betwaylogin[L6,K11]-IsCT抑菌活性的影响
按Huimark等(1980)配制pH2.0~11.0缓冲液,将betwaylogin[L6,K11]-IsCT用pH2.0~11.0缓冲液配制成终浓度为0.5mg/mL溶液,37℃孵育30min,琼脂扩散法检测其对大肠杆菌的抑菌活性,以pH2.0~11.0缓冲液为对照。
1.4.5 betwaylogin[L6,K11]-IsCT 对胃蛋白酶稳定性研究
取betwaylogin[L6,K11]-IsCT分别与不同胃蛋白酶浓度的人工胃液配制成相应的0.5mg/mLbetwaylogin溶液,放入37℃恒温水浴锅中分别反应1、2h,再放入70℃恒温水浴10min,使酶失活。琼脂扩散法测定反应物抑菌活性,以未处理的betwaylogin溶液和不同胃蛋白酶浓度的人工胃液为对照。
1.4.6 betwaylogin[L6,K11]-IsCT 对胰蛋白酶稳定性研究
取betwaylogin[L6,K11]-IsCT分别与不同胰蛋白酶浓度的人工肠液配制成相应的0.5mg/mLbetwaylogin溶液,放入37℃恒温水浴锅中分别反应1、2h,再放入70℃恒温水浴10min,使酶失活。琼脂扩散法测定反应物抑菌活性,以未处理的betwaylogin溶液和不同胰蛋白酶浓度的人工肠液为对照。
2、结果与分析 2.1 琼脂扩散法鉴定betwaylogin[L6,K11]-IsCT 的抑菌活性

0.5mg/mL[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)的抑菌效果见图1。由图1可知,betwaylogin[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌效果,且存在一定差异。其中对大肠杆菌抑菌效果更为明显,金黄色葡萄球菌抑菌圈直径略小,且抑菌圈边缘较为模糊,说明该betwaylogin[L6,K11]-IsCT对于革兰氏阴性菌效果优于革兰氏阳性菌。


2.2 betwaylogin[L6,K11]-IsCT 对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)

微量稀释法测定betwaylogin[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌的最小抑菌浓度,培养15h后,结果见表1。由表1可知,[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌的MIC为50μg/mL。
 
表1   微量稀释法测定betwaylogin对大肠杆菌的MIC
注:“+”表示肉眼可以清晰看见细菌生长;“—”表示细菌生长抑制,肉眼未见培养基浑浊或沉淀。
2.3 betwaylogin[L6,K11]-IsCT 热稳定性的测定


将配制好的0.5mg/mLpH7.0的betwaylogin[L6,K11]-IsCT溶液,分别于4、37、55、75、95、121℃,处理30min后,检测其对大肠杆菌的抑菌活性,测量抑菌圈大小,结果见图2。由图2可知,经过各温度处理后的betwaylogin[L6,K11]-IsCT产生的抑菌圈大小没有发生变化(均为6mm),甚至经过高温121℃处理,对大肠杆菌的抑菌性能依旧没有明显变化,说明betwaylogin[L6,K11]-IsCT对高温具有很强的耐受性。

2.4 pH 对betwaylogin[L6,K11]-IsCT抑菌活性的影响

betwaylogin[L6,K11]-IsCT经过pH2.0~11.0缓冲液处理后,观测其对大肠杆菌的抑菌效果,测量抑菌圈大小,结果见图3。由图3可知,在pH为6.0和7.0时抑菌圈最大,为6mm,而在pH为2.0~5.0和9.0~11.0时,抑菌圈降至5mm。说明了酸碱环境对[L6,K11]-IsCT抑菌活性有一定程度的影响,但整体而言,[L6,K11]-IsCT在极端pH环境中仍能维持较高的抑菌活性。由此可见,该betwaylogin[L6,K11]-IsCT具有较好的酸碱耐受性,在不同的pH 环境中具有较好的稳定性。

2.5 人工胃液对[L6,K11]-IsCT 抑菌活性的影响

以不同胃蛋白酶浓度的人工胃液配制好betwaylogin[L6,K11]-IsCT溶液(0.5mg/mL),分别于37℃恒温水浴1、2h后终止反应,观测反应物对大肠杆菌的抑菌效果,测量抑菌圈大小,结果见图。由图4可知,当胃蛋白酶浓度为1.25mg/mL时,处理1、2h后,[L6,K11]-IsCT抑菌活性没有发生变化,抑菌圈仍为6mm;而当胃蛋白酶浓度为10mg/mL时,处理2h后,[L6,K11]-IsCT抑菌活性有一定的损耗,抑菌圈降到了4.5mm。表明[L6,K11]-IsCT抑菌活性会随着胃蛋白酶浓度的升高和处理时间延长有一定的损耗,但整体仍能保持较高的抑菌水平,足见其对人工胃液具有较好的耐受性。


2.6 人工肠液对[L6,K11]-IsCT 抑菌性能的影响

按照已述试验方法,采用胰蛋白酶浓度为0.625mg/mL的人工肠液处理betwaylogin[L6,K11]-IsCT(0.5mg/mL),结果见图5。由图5可知,处理1h后,其活性完全丧失。


 
3、讨论 betwaylogin与传统抗生素的作用机制有明显的不同。在解释betwaylogin的抗菌机制时,现在比较流行的有“桶-板”模型、“毯式”模型(Tim 等,2006)。“桶-板”模型认为betwaylogin通过以下步骤表现出杀菌活性:①阳离子型的betwaylogin与细菌外膜上带负电的磷脂分子,借静电作用吸附而结合;②通过分子双亲性结构中疏水段的疏水作用,使分子插入到膜脂双分子层内,扰乱膜的分子结构;③betwaylogin分子间移动、聚集成“桶”样的通道结构,该结构的外围疏水基团与膜脂肪链结合,中央的亲水性基团形成跨膜离子通道,从而使胞内离子大量泄漏,渗透压发生改变,而起杀菌作用。“地毯”模型认为双亲性α-螺旋结构的betwaylogin与膜磷脂分子作用后,可扰乱膜脂分子原来的排列秩序,改变细胞膜的结构和功能,而起到杀菌作用。

通过体外抑菌试验,采用琼脂扩散法测定了betwaylogin[L6,K11]-IsCT对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌性能。试验结果表明,[L6,K11]-IsCT对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制作用,但具体采用上述哪种膜定位方式有待于进一步研究。另外,研究结果发现相对于金黄色葡萄球菌,[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌具有很好的抑制作用,说明betwaylogin[L6,K11]-IsCT对革兰氏阴性菌抑菌效果优于革兰氏阳性菌。其原因可能为:①革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构和肽聚糖交联方式不同所引起的(肖凤伟等,2012);②betwaylogin品种和结构均不相同,[L6,K11]-IsCT为线性分子,表现出较强的阳离子特征,且缺乏分子内二硫键,相比其他种类betwaylogin,其一级结构(即氨基酸残基排列顺序、数目、种类)、二级结构(α2螺旋、β2转角、β2片层)表现出明显差异,结构不同直接导致性质的不同(Dai等,2001)。进一步通过微量稀释法检测了[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌的最小抑菌浓度,其结果为50μg/mL。

以大肠杆菌为指示菌,采用琼脂扩散法检测其在不同环境中的稳定性。研究结果表明,[L6,K11]-IsCT对高温具有很好的耐受性,即使经过121℃高温处理,其活性仍然能维持不变。所以,betwaylogin[L6,K11]-IsCT能够耐受饲料加工过程中高温的剧烈条件,且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能,保持饲料品质,延长贮存期限。同时[L6,K11]-IsCT经极端pH环境处理后,其抑菌活性仅有较小程度的损耗,所以在动物饲喂过程中,[L6,K11]-IsCT能够很好的耐受不同酸碱环境,保证其顺利到达作用部位。另外,在人工胃液中,[L6,K11]-IsCT会随着胃蛋白酶浓度的提高和处理时间的延长,而加剧活性损失,但活性损失幅度不大,可见其对人工胃液的耐受性还是较为理想的。

重组表皮生长因子(rhEGF)是一种小分子多肽类物质。取重组人表皮生长因子(rhEGF)分别加入到人工胃液(pH2.0)、人工肠液(pH6.8)和加胃蛋白酶的人工胃液、加胰酶的人工肠液中,定时取样,采用放射免疫分析法测定不同时间内rhEGF含量,结果发现,rhEGF在人工胃液和人工肠液中的含量随时间的延长而呈下降趋势,1h后人工胃液和人工肠液中,rhEGF浓度分别下降43.46%和21.91%;但在酶的存在下1h后rhEGF浓度分别下降89.62%和79.52% (叶盛英等,2003)。同样,本试验发现,即使没有[L6,K11]-IsCT的存在,胰蛋白酶浓度为10、2.5和1.25mg/mL的人工肠液也能产生明显的抑菌圈;而当胰蛋白酶浓度达到0.625mg/mL时,没有抑菌圈出现。所以,选取胰蛋白酶浓度为0.625mg/mL的人工肠液处理betwaylogin,结果发现,处理1h后,其活性完全丧失。这可能与[L6,K11]-IsCT序列中具有胰蛋白酶能够识别酶切位点有关,而且[L6,K11]-IsCT为线性肽,不能像其他betwaylogin一样形成空间结构隐藏酶切位点,所以不能抵抗胰蛋白酶的作用。

因此,要想将[L6,K11]-IsCT更好的应用于产品开发,应避免与酶的长时间接触,可以将该类产品制成缓释剂,当到达作用部位后,再将产品释放出来,这样可以缩短产品与酶的接触时间,发挥局部治疗作用,或在产品中加入抑酶剂等,有待于进一步研究。


 
本篇重点摘录
研究betwaylogin[L6,K11]-IsCT对常见致病菌的抑制和杀灭作用,结果发现:
1.相对于金黄色葡萄球菌,betwaylogin[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌具有更好的抑菌作用,说明betwaylogin[L6,K11]-IsCT对革兰氏阴性菌效果优于革兰氏阳性菌。
2.betwaylogin[L6,K11]-IsCT对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。
3.betwaylogin[L6,K11]-IsCT对高温具有很强的耐受性,即使经过121℃高温处理,其活性仍维持不变。所以,betwaylogin[L6,K11]-IsCT能耐受饲料加工过程中高温的剧烈条件,且可在饲料保存过程中保持饲料品质,延长贮存期限。
4.betwaylogin[L6,K11]-IsCT具有较好的酸碱耐受性,在动物饲喂过程中,可很好地耐受不同酸碱环境,保证其顺利到达作用部位。
5.betwaylogin[L6,K11]-IsCT对人工胃液具有较好的耐受性

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